Produción de proteínas recombinantes en la Argentina

Producción de Proteínas Recombinantes
a Nivel Industrial en la Argentina

INTRODUCCION

Las proteínas recombinantes son aquellas proteínas producidas en el laboratorio mediante ingeniería genética en células distintas a las que se producen en la naturaleza. Las ventajas que presentan son varias:
• Obtención de proteínas de distintos orígenes, en organismos fácilmente cultivables.
• Obtención de grandes cantidades del producto, de una forma más fácil y reproducible, en comparación con el obtenido por extracción a partir de su fuente natural.
• Obtención de productos libres de patógenos y otros riesgos potenciales. Esto es particularmente importante en el caso de los productos farmacéuticos. Por ejemplo, los factores de coagulación o la hormona de crecimiento pueden administrarse libres de contaminación como proteínas recombinantes, en lugar de proteínas purificadas de sangre e hipófisis humanas, respectivamente.
• Pueden producirse proteínas que no existen en la naturaleza, como los anticuerpos de cadena simple, útiles en el diagnóstico y tratamiento de algunas enfermedades.
Prácticamente todas las enzimas que se emplean en la industria (farmacéutica, alimenticia, textil, papel, química, detergentes, etc.) son recombinantes. Si bien muchas de ellas son microbianas, resulta más fácil y reproducible su obtención a partir de microbios conocidos en profundidad y fácilmente cultivables. Entre los sistemas utilizados para la producción de las proteínas recombinantes se encuentran Escherischia coli , células de ovario de hámster chino CHO , líneas celulares de riñón de hámster bebe y Sacharomyces cerevisiae , siendo el más elegido para la producción de fármacos en uso humano la expresión en células eucariotas, como las levaduras y CHO, debido a la necesidad del procesamiento postraduccionales ( por ejemplo, glicosilaciones).
Además existen sistemas alternativos que podrían abaratar los costos de producción, como las plantas y los animales transgénicos, pero estos están aún en etapas de desarrollo o evaluación.
El área con mayor impacto es la de biofármacos, debido a la posibilidad de producir de manera más eficiente medicamentos para un gran número de enfermedades (diabetes, cáncer, insuficiencias cardiovasculares, hemofilia, etc).
El primer biofármaco (o medicamento biológico) apareció en 1982. Era la insulina recombinante humana, producida en las instalaciones del laboratorio Eli Lilly, en Indianápolis, Estados Unidos. El gen de la insulina humana fue introducido en una bacteria que produjo la misma sustancia que elabora el páncreas, y así se benefició a millones de diabéticos de todo el mundo.
Comparado con las drogas químicas pequeñas, las proteínas tienen alta especificidad y actividad en concentraciones relativamente bajas.
Actualmente, más de 350 biofármacos están siendo probados para el tratamiento de más de 150 enfermedades y se estima que para el año 2012 los medicamentos biotecnológicos representarán el 12% del total de las ventas mundiales de medicamentos de prescripción.
Para asegurar la consistencia en las características de los productos finales, y los perfiles de seguridad y eficacia, tanto la fuente del material, los procesos de manufactura, la formulación así como las condiciones de almacenaje deben ser cuidadosamente seguidas y controladas, cumpliendo las exigencias GMP específicas para los productos biotecnológicos. Para tal fin existen organismos encargados de hacer cumplir dichas normas, en la Argentina esta tarea la lleva a cabo la ANMAT (Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología médica) a través de su dependencia el INAME (Instituto Nacional de Medicamentos).

CAPITULO 1: Qué es una proteína recombinante

Las proteínas recombinantes son aquellas proteínas producidas en el laboratorio mediante ingeniería genética en células distintas a las que se producen en la naturaleza, por ejemplo insulina humana producida en E. coli. Se aplican en uso médico, veterinario e industrial, siendo las más promocionadas las aplicadas en medicina clasificadas como Biofármacos con base a proteína.
Los Biofármacos son medicamentos de origen biológico, o sea producidos a partir de un ser vivo, pueden tener base a proteína o ácido nucleico. Los de base a proteína son de alta similitud o iguales a proteínas humanas, siendo más complejos y lábiles que gran parte de los medicamentos compuestos de pequeñas moléculas (fármacos de síntesis química).
Otro elemento distintivo de los productos con base a proteínas es que en la mayoría de los casos son difíciles de caracterizar. La proteína más básica y simple es compleja en sí misma, y hay estructuras moleculares de las proteínas que no pueden ser diferenciadas con la tecnología disponible hoy en día. Por este motivo la producción de medicamentos biológicos genéricos (Biogenéricos) suele ser más difícil que la producción de medicamentos de síntesis química.
Las proteínas recombinantes humanas revolucionaron el tratamiento de diversas enfermedades, como por ejemplo diabetes, hepatitis, cáncer.
El ejemplo más conocido de proteína recombinante ( debido a su uso por parte del jugador de futbol Lionel Messí) es la hormona de crecimiento humano, una sustancia que la hipófisis produce en forma natural, pero que en algunas personas está disminuida y causa diversas alteraciones y enfermedades. Una de ellas, baja estatura.
Como ya se menciono, igualmente existen proteínas recombinantes aplicadas a otras áreas fuera del área terapéutica, como por ejemplo área alimenticia, investigación y diagnóstico

CAPITULO 2: Sectores en la empresa - Pasos hasta el producto final

La empresa.
La empresa debe contar con departamentos o áreas coordinadas y especializadas para el desarrollo de proteínas recombinantes.
Es muy importante contar con una Dirección de Desarrollo Tecnológico (DDT) con la misión de convertir resultados científicos en productos finales y/o tecnologías. El proceso completo de desarrollo abarca desde el establecimiento de las tecnologías a nivel de laboratorio con todos los parámetros de calidad requeridos, hasta su escalado y producción de lotes. Todo este proceso debe ser planeado metodológicamente en una dirección integrada de proyectos, que garantice una correcta planificación de los objetivos y una revisión sistemática de su avance. En esta Dirección se combinan las normas de buenas prácticas de laboratorio y buenas prácticas de producción sustentadas en un sistema de calidad documentado que garantiza la máxima calidad y seguridad de los productos y tecnologías que se desarrollan.
Se debe contar con laboratorios especializados en microbiología, fermentación de microorganismos, purificación de biomoléculas, formulación, métodos analíticos y sector de producción de lotes además de un personal formado por científicos y tecnólogos con experiencia en diversas áreas de la biotecnología, farmacia, bioquímica, biología entre otros, para desarrollar temas que incluyen modificación genética de microorganismos, fermentación de bacterias, purificación de proteínas, formulación y pruebas de estabilidad y desarrollo de técnicas analíticas.
Se debe evaluar periódicamente la influencia de los aditivos y del material de empaque en la actividad biológica del principio activo, de los excipientes para la estabilización de un producto, estudiar la estabilidad acelerada de un producto y la estabilidad en tiempo real, el diseño de nuevos envases primario y secundario para los productos en fase de estudios clínicos.
Esta actividad permite lograr presentaciones para los productos que le confieren, entre otros, facilidad y seguridad de administración, alto valor agregado y así un alto nivel competitivo.
El Departamento de Aseguramiento de la Calidad debe garantizar que se lleven a cabo las acciones planificadas y sistemáticas que son necesarias para proporcionar la confianza de que los productos y servicios cumplen los requisitos de calidad establecidos. Debe controlar el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Producción (BPP), Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) y Buenas Prácticas Clínicas (BPC). Las siglas en inglés son GPP, GLP y GCP, respectivamente.
El Departamento de Regulaciones debe tener a su cargo la confección de los expedientes de registro de todos los productos de la empresa y los trámites correspondientes a nuevos registros, renovaciones, autorizaciones de ensayos clínicos y modificaciones de registros ante las autoridades reguladoras del país de producción y otros países. Debe participar en la etapa de desarrollo de nuevos productos y en la evaluación de los cambios, asesorando desde el punto de vista de las regulaciones vigentes. Para esos propósitos recibe información e interactúa con otras áreas de la institución.


Tratamiento de efluentes y residuos de laboratorio
En el laboratorio se manejan gran cantidad de productos y se efectúan diversas operaciones que generan residuos, en la mayoría de los casos peligrosos para la salud y el medio ambiente.
Unas adecuadas condiciones de trabajo en el laboratorio implican inevitablemente el control, tratamiento y eliminación de los residuos generados en el mismo, por lo que su gestión es un aspecto imprescindible en la organización de todo laboratorio.
Residuos biológicos y orgánicos deben almacenarse en recipientes específicos convenientemente señalizados y retirarse siguiendo procesos preestablecidos y validados. Normalmente se esterilizan y se incineran. Debe controlarse la temperatura y la posible toxicidad de los humos producidos. La instalación de un incinerador sólo está justificada por un volumen importante de residuos a incinerar o por una especial peligrosidad de los mismos. En ciertos casos se pueden emplear las propias calderas disponibles en los edificios.
La gestión es el conjunto de actividades encaminadas a dar a los residuos tóxicos y peligrosos el destino final más adecuado de acuerdo con sus características; comprende las operaciones de recolección, clasificación, almacenamiento, transporte, tratamiento, recuperación y eliminación.
La adecuada gestión de los residuos en el laboratorio no es solamente una necesidad con el objeto de mejorar las condiciones de trabajo sino que constituye una pieza fundamental en la aplicación de criterios de calidad y gestión ambiental, siendo también una de las exigencias de aplicación de las buenas prácticas (BPL o GLP). A primera vista todo ello implica un costo, pero es evidente que repercute positivamente en la gestión del laboratorio, siendo rentable a mediano plazo.
Existe un grupo de residuos que están afectados por disposiciones legales específicas, como son los residuos radiactivos, los residuos cancerígenos y los residuos biológicos. Ello implica que dichos residuos deben tener una identificación propia que permita reconocerlos claramente y gestionarlos de manera diferenciada de acuerdo con las prescripciones legislativas específicas.

Proceso de producción de una proteína recombinante en bacterias (E. Coli).

Estrategias de diseño de procesos

Al diseñar un proceso se deben tener en cuenta varios ítems:

A- Conocer las propiedades físicas y químicas básicas del principio activo y características del producto final, como definir pureza requerida.
El uso determina la pureza. Para agentes terapéuticos se requiere un alto grado de pureza del principio activo. Se tolera un máximo de 100 ppm de impurezas ó de 10 pg/dosis, además de estar libre de pirógenos.
B- Definir perfectamente el material de partida. Muchas veces la metodología de purificación condiciona etapas de producción. Por ejemplo, pueden existir componentes del medio de cultivo que posean sustancias muy similares al producto final que, por lo tanto, interfieren en la purificación del mismo. En este caso se debe eliminar ese componente del medio de cultivo.
C- Trazar diferentes esquemas tentativos de separación y purificación y llevarlos a etapas de laboratorio y piloto.


Algunas reglas que se siguen para esto son:

a. Elegir etapas sucesivas de procesos basados en diferentes propiedades fisicoquímicas.
b. Separar las impurezas de mayor proporción en las primeras etapas.
c. Luego de concentrar, usar en las primeras etapas de purificación un método con mayor resolución. Estos poseen un alto rendimiento aunque no brinden la mayor pureza. En cierta medida lo que se hace es seguir concentrando para reducir la cantidad de muestra (volumen) a tratar en las etapas posteriores.
d. Dejar el proceso más complejo (y por lo general más caro) para el final.

Desarrollo y obtención de la cepa por ingeniería genética.
Para el desarrollo del proceso y la obtención del producto, una vez que se ha comprobado la función del principio activo y que posee un potencial comercial, el siguiente paso es diseñar un proceso a nivel de laboratorio para determinar las mejores condiciones para el cultivo con el objetivo de alcanzar una alta productividad que haga rentable al proceso.
A nivel laboratorio las formas más sencillas y productivas que actualmente se utilizan son las del crecimiento de un microorganismo que genere el producto de interés.
Contando con la información de la secuencia del factor de interés, por medio de ingeniería genética se puede hacer que el gen o parte del mismo se exprese en un sistema bacteriano. De los sistemas más usualmente utilizados se encuentra el de Escherichia coli. El gen codificante para la proteína químicamente sintetizado se inserta en el vector controlada por el promotor, obteniéndose el plásmido.
Con la elección de cepa y vector se busca expresar la proteína en el medio facilitando enormemente la extracción y purificación, no son muchos los sistemas que trabajan de esta manera y sean altamente eficientes. De no ser posible esto la preferencia es la expresión de la proteína en su forma soluble o en última instancia, formando cuerpos de inclusión. La elección del vector no solo se basa en la capacidad de expresar las proteínas en el destino deseado sino que también sea un sistema económico para inducir.
Igualmente, depende de que producto se desea obtener.

Esquema 1. Pasos generales más comunes a realizar en ingeniería genética para obtener una cepa productora.
La síntesis del gen
Se realiza por el método de reacción en cadena de la polimerasa conocido como PCR, en donde el ADN del gen de interés se amplifica por medio de la acción de una polimerasa como puede ser la Taq polimerasa.
- Extracción de cualquier vector de una célula
El procedimiento suele ser, lisar la célula con detergentes y quelantes de Ca y Mg para romper y desestabilizar la membrana, respectivamente. La centrifugación separa los cuerpos más grandes de los pequeños, el uso de solventes orgánicos (como el ácido tricloroacético), de proteasas y RNAsas permite la separación de proteínas y ARN del ADN. El uso de una base fuerte (NaOH) permite la desnaturalización del ADN y luego el cambio brusco de pH permite que los ADNs de menor peso (el del vector) se renaturalicen rápidamente mientras que los de mayor peso forman agregados (ADN bacteriano) lo que luego por centrifugación se logra la separación de ambas ADN. Todos los procesos se llevan a cabo en sistemas donde están regulados el pH, concentraciones de cofactores para el funcionamiento de las enzimas, la temperatura, la presión osmótica y la fuerza iónica.
- Digestión enzimática con enzimas de restricción
En este paso conociendo la secuencia del inserto y que los vectores tienen un sitio de restricción se elige con que enzimas digerir para que luego la unión inserto y el vector sea óptima.

- Unión inserto vector (ligación)
Obtenidos los cortes de restricción en este paso se utiliza la parte de la maquinaria de síntesis de ADN que se encarga de unir las bases. La encargada de este proceso es la enzima ligasa.
- Transformación
En este paso a las bacterias se les introduce el vector con el inserto, para ello las bacterias se las vuelve competentes, es decir que pueden captar ADN del medio, en este caso el del vector. Esto se logra utilizando energía eléctrica (electroporación) o lavados con soluciones de Ca o Mg, estos procesos tienen como objetivo crear poros parciales en las membranas para permitir el paso del vector.
- Búsqueda de los clones positivos (screening)
Es el proceso por el cual se buscan los clones que han incorporado el vector con el inserto para realizar su separación de los que no lo han incorporado.
Controles durante la obtención de la cepa recombinante
Al menos se deben realizar los siguientes controles:
- La Presencia del plásmido o vector por medio de gel en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). Si al correr el gel se observa que la banda de la muestra es distinta al del vector original, es indicación de que el vector fue modificado. Al introducir el inserto y hacer el SDS-PAGE los vectores corren distintos.
- Durante la digestión enzimática se observa hasta que punto llegó la digestión del vector por medio de un gel en condiciones nativas. En estas condiciones el vector genera tres bandas que corresponde a su forma lineal (corre más rápido) que se encuentra primero (desde abajo hacia arriba del gel) le sigue su forma enrollada pero con cortes que le quitan tensión a la molécula, y por último el vector sin cortes en su forma plegada. Si la digestión fue bien realizada en el caso de utilizar dos enzimas de restricción, en el gel se deberá observar dos bandas, correspondientes a dos ADNs lineales, una al fragmento más pequeño en donde se liberan lo sitios de restricción y la otra al resto de la molécula del vector. En el caso de utilizar una sola enzima se deberá observar la banda correspondiente al vector lineal.
- En el proceso de unión vector-gen sintético, se verifica que porcentaje se ha alcanzado. Solo sobreviven en el medio de cultivo con antibiótico las bacterias que hayan incorporado el vector ligado ya que de lo contrario morirán por no poder generan la resistencia que llevan (el DNA lineal no puede ser transcripto).

En la selección, las células transformadas se someten a un cultivo con antibiótico si sobreviven es porque incorporaron el vector de lo contrario mueren debido a que el vector lleva la resistencia al antibiótico. Generalmente los vectores tienen un segundo sistema de diferenciación en donde se inserta el gen en estudio esto le da cierta característica a la colonia que incorporaron el gen-sintético. Uno de los sistemas más comunes es el de gen lacZ  que hace que las colonias se vean azules y las que recibieron el plásmido junto con el gen sintético se ven blancas debido a que el gen fue cortado por la secuencia del inserto.


Investigación y desarrollo de las condiciones para el cultivo
Una vez obtenida la cepa productora, en el caso del estudio elegido E. coli con el vector, se procede al estudio de las mejores condiciones del cultivo para la producción de la proteína.

A nivel laboratorio
- Cultivo continuo.
En un primer paso se utiliza el cultivo continuo para determinar las características fisiológicas de la cepa como la velocidad de crecimiento y como varía su producción según la fuente de sustrato, que factores de crecimiento son necesarios, y cuales son las condiciones óptimas de pH y temperatura, entre las características más importantes.
Con este sistema se puede mantener constante la velocidad de crecimiento variando la composición del medio y parámetros del cultivo o viceversa.
Inconvenientes.
• Inestabilidad genética de la cepa, pérdida de plásmidos.
• Alta probabilidad de contaminación.
• Dificultad en establecer estado estacionario.
Debido a esto en la industria muchas veces se recurre a datos bibliográficos de esta manera se evita la inversión en investigación.
- Cultivo batch alimentado.
Determinados los estudios en el cultivo continuo se procede a utilizar un cultivo batch alimentado. Este cultivo se inicia a partir de un cultivo en batch. Aquí un cultivo en batch se alimenta continuamente con medio nutritivo fresco. Si el nutriente que se alimenta es el limitante del crecimiento, esta técnica permite controlar la velocidad de crecimiento (μ) del microorganismo.
Es útil en procesos en los que el crecimiento celular y/o la formación de producto son sensibles a la concentración del sustrato limitante, o sea cuando el rendimiento celular o la productividad de biomasa o del producto es lo que interesa. Este método evita fenómenos de inhibición por sustrato.

Metodología de trabajo. (Las condiciones de cultivo pueden cambiar. Las que se expresan son a modo de ejemplo).

- Cultivo primario: 1mL del medio almacenado se cultivan en 30mL de medio suplementado con el antibiótico de selección en frascos 250mL. Incubado a 37ºC y 200 rpm durante 10 h.

- Cultivo secundario: 0.7mL del cultivo primario se cultivan en 70mL de medio de cultivo en frascos de 500mL, mismas condiciones que el cultivo primario durante 9h. 140 ml de cultivo se inoculan en 2.5L de medio de producción en un fermentador de 5L.

- Fermentación:
- pH: 7 regulado con 2M NaOH y 1M H2SO4,
- Temperatura: generalmente 37ºC,
- RPM: 600,
- Caudal de aireación: 4L/min,
- Oxígeno disuelto: aproximadamente 20% de la saturación del aire.
- Alimentación: fuente de carbono y energía (glucosa, glicerol, etc.)

- Controles:

- Determinación de la densidad celular por densidad óptica a 600nm (OD600). El peso seco se estima relacionado linealmente el peso seco y la OD600.

- La concentración de glucosa (o glicerol) se puede medir con ensayos enzimáticos utilizados en glucemia ( o triglicéridos).

- La concentración de fosfato se determina por un kit de diagnóstico basado en la reacción entre el fosfato y el amonio molibdato para formar ácido fosfomolibdico, que forma un complejo azul con sulfato amónico ferroso. Las proteínas en las muestras se precipitan con ácido tricloroacético antes de analizar el fosfato para evitar interferencia.

-La proteína recombinante producida se mide con el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) y rutinariamente medido por SDS-PAGE y Western Blot para determinar su presencia. Este último es cualitativo ya que sus valores son mayores comparado con el método ELISA que es más sensible (que es cuantitativo).

A nivel producción.
Escalado
Del proceso de laboratorio se debe pasar a los procesos de escalado piloto y producción.
- Escalado piloto: Se determinan las condiciones óptimas al ir escalando el proceso de laboratorio. Este paso es importante ya que aquí se validan los procesos por los entes reguladores y son los que se utilizarán para las condiciones de producciones mayores. También es necesario para corregir inconvenientes ya que en instalaciones mayores serían muy costosas.
Los posibles cambios de bioreactor son una posibilidad que en muchos casos se ve limitada en la empresa por el costo de los mismos. Si se considera el valor del producto final y la rentabilidad del mismo, la mejora productiva que puede acarrear el pasaje a otro bioreactor (o sistema en el mismo), se ve reflejado en una gran inversión.

- Producción: Una vez puesto a punto y validado el proceso de escalado piloto, se diseña la planta para una mayor producción. En este proceso se tienen los siguientes inconvenientes:
• Disminución del rendimiento
• Cambio de cinética
• Efecto de la esterilización
• Efecto del inóculo
• Problemas de transporte
Entre los criterios de escalado se encuentran:
• Mantener constante la potencia por volumen utilizada, P/V.
• Mantener constante el coeficiente volumétrico de transferencia de masa, kLa.
• Mantener constante la velocidad de la punta de las paletas del agitador, nd.
• Mantener constante el tiempo de mezclado.


- Purificación

Para la extracción de la preparación cruda del material de origen se utiliza una centrífuga de discos de tazón abierto, o se realiza una filtración que retenga partículas más pequeñas que no pude separar la centrífuga. Los dos son sistemas cerrados que evitan la formación de aerosoles, lo que los hacen ideal para el manejo de microorganismos patógenos o sustancias tóxicas.
Estos equipos deben contar con instalaciones que regulen y controlen los fenómenos de generación de calor, formación de aerosoles y de ruido.
La más grave limitación es el taponamiento (fouling) de las membranas, lo que disminuye el flujo.

El taponamiento irreversible puede ocurrir por las siguientes circunstancias
• Ciertas proteínas se adsorben a la superficie de la membrana.
• Los desechos celulares forman una fina capa sobre la membrana.
• Los compuestos químicos utilizados normalmente como antiespumantes en una fermentación pueden ocluir irreversiblemente los poros de las membranas.

Existen protocolos de ciclos de lavado para eliminar los depósitos sobre la superficie de las membranas dependiente del tipo de muestra y las características químicas de las membranas.

A medida que aumenta el diámetro de la partícula a separar, el costo de separación por centrifugación decrece mientras que para la filtración no se ve afectado. Con la filtración puede ser que las membranas no sean compatibles con el producto o no se pueda eliminar la interacción con los antiespumantes.

La centrifugación requiere un mayor capital inicial y poco de mantenimiento en cambio en los sistemas de filtración se requiere la compra de cartuchos de membranas periódicamente lo que se lleva el mayor capital.
Para la elección de estas técnicas se depende de la escala del proceso, cuando se requieren procesar volúmenes muy grandes la centrifugación se hace mucha más competitiva a la filtración. Pero en este caso se complementan.


En el caso de tratarse de una proteína con destino extracelular, los métodos antes descriptos serían suficientes para entrar en el siguiente paso de purificación, pero lo que ocurre con mayor frecuencia es que las proteínas recombinantes formen cuerpos de inclusión o en menor medida, encontrarse en el citoplasma, de forma soluble.
Si se trata de los últimos dos casos, es necesaria la lisis celular para liberar el material proteico.
A escala de laboratorio, esto se logra mediante ruptura con ultrasonido o lisis química. A gran escala lo más común es el uso de homogeneizadores por tener mayor capacidad. El material biológico se coloca bajo una fuerte presión hidrostática (alrededor de 500 atmósferas) y la presión se libera bruscamente permitiendo que el líquido salga por una válvula, lo que ocasiona la lisis celular.
Si la proteína es soluble, una vez que se han lisado las células, los restos celulares se retiran bien por centrifugación de gran capacidad a baja velocidad o por filtración en membrana. Al final se obtiene un líquido libre de células que es el que sufre los tratamientos posteriores para aislar y en su caso purificar el producto de interés.
Si la proteína será purificada a partir de los cuerpos de inclusión, el producto de interés es el precipitado de la solución lisada, tras la centrifugación. Este material luego debe ser resuspendido para su purificación.

La purificación final forma parte de las etapas más caras en la recuperación del producto implican el uso de métodos cromatográficos. Tales métodos son de especial valor para la purificación de materiales biológicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparación de materiales farmacéuticos, reactivos de diagnóstico y reactivos para investigación. Los distintos métodos cromatográficos que existen según su mecanismo de separación son: filtración en gel (peso molecular), cromatografía de adsorción (interacciones hidrofóbicas), cromatografía de intercambio iónico (carga), cromatografía de afinidad (actividad biológica) y electroenfoque (punto isoeléctrico).

Esquema general del proceso (microorganismo que genera el producto de interés)


Esquema 2: Procesos generales a desarrollar para la obtención de una proteína recombinante en bacterias

No solo el producto debe ser purificado sino también los insumos del proceso como también las instalaciones o sea contar con materias primas y elementos esterilizados libres de potenciales contaminantes del proceso. Los siguientes esquemas muestran posibles diseño para la esterilización de los insumos del reactor por medios de filtros.

- Parámetros de evaluación de la purificación.

Durante los procesos de purificación se llevan a cabo controles para determinar su eficiencia y determinar si los métodos utilizados son los óptimos. Este paso es el que determina el tipo de inversión a realizar.

Rendimiento: % = cantidad de producto después de la purificación x 100/cantidad de producto en el material de partida

Pureza: Actividad específica (AE) = cantidad de proteínas de interés /cantidad total de proteínas

Factor de purificación = AE luego de la purificación/AE antes de la purificación

Costo del producto = costo del material de partida + expensas /rendimiento

Expensas = f (costo de materiales de purificación, equipamiento, personal, etc.)

- Estabilización final del producto.

Los ensayos de estabilidad demuestran cómo cambian los productos farmacéuticos envasados y no envasados con el tiempo según las condiciones de temperatura, humedad y luz. Los datos obtenidos se emplean para establecer duración de almacenaje y las condiciones de almacenamiento de los productos.

- Secado del producto.

En este paso se utilizaría uno de los procesos más utilizados que es el liofilizado que consiste en deshidratar una sustancia congelándolo en un primer paso y luego eliminando el agua por vaporización mediante presiones bajas cercanas al vacío.

- Empaque.

Dependiendo el mercado a donde se dirija el producto el envase deberá cumplir con normas preestablecidas para asegurar el producto bajo ciertas condiciones de almacenaje además de la estética de la cual se encargará el Departamento de Marketing.


- Aseguramiento de la calidad.

Una vez terminado el proceso todo lote debe estar identificado junto con un certificado de calidad.

CAPITULO 3: Uso salud humana, uso alimenticio, uso agropecuario

Empresas biotecnológicas
Las empresas de biotecnología realizan procesos tanto en fases de investigación y desarrollo como en aplicaciones productivas. Entre sus productos se encuentran las proteínas recombinantes, a continuación separadas en tres áreas mayoritarias:
Producción agropecuaria:
- Inoculantes: producidos a partir de cepas de bacterias, destinados a aumentar la fertilidad de la producción agropecuaria.

- Biopesticidas y bioherbicidas

- Sanidad animal: vacunas y marcadores genéticos.

Ingredientes alimentarios para bioprocesamiento:

-Coadyuvantes tecnológicos: enzimas y cultivos.

Algunas enzimas recombinantes destinadas a la industria alimenticia son:
• quimosina que sustituye a la natural obtenida del estómago de terneros, y que se obtiene a partir de los hongos Kluyveromyces lactis y Aspergillus niger transformados genéticamente con genes de vacuno. Uso coagulación de las proteínas de la leche (caseína). Influencia en el sabor y aceleración de la maduración.
• α-amilasa obtenida a partir de Bacillus subtilis recombinante. Esta enzima licua el almidón y lo convierte en dextrina en la producción de jarabes. En la industria cervecera, favorece la retención de la humedad del producto y baja el contenido calórico del producto. Además mejora la calidad del pan disminuyendo la viscosidad de la pasta. Produce una miga muy blanca y mejora la coloración de la superficie.
• Pectinasas producidas por Aspergillus oryzae transformada con el gen de A. aculeatus. Permiten la clarificación de jugos concentrados al degradar las pectinas provenientes de restos de semillas.
• Glucosa oxidasa y catalasa obtenidas a partir de Aspergillus niger recombinantes. Estas enzimas se utilizan para eliminar azúcares de huevos y evitan que aparezcan olores anormales durante la deshidratación de los mismos.
• Lipasa obtenida en Aspergillus oryzae recombinante se utilizan en la fabricación de concentrados de aceites de pescado.
• Glucosa isomerasa proveniente de Streptomyces lividens al que se le ha inserto el gen de Actinoplanes. Permite obtener, a partir de glucosa, jarabes ricos en fructosa, con mayor poder endulzante.
• β-glucanasa producida por levaduras cerveceras recombinantes, que facilitan la filtración del producto.

Salud humana:
-Actividades de diagnóstico (biosensores, inmunodiagnósticos, pruebas de genes, entre otros)
- Actividades terapéuticas (producción de vacunas, reactivos, terapia genética, estimulantes inmunes, biofarmacéuticos).



Tabla 1: Proteínas recombinantes para uso en salud humana. (1)

En el año 2005 en la Argentina la ANMAT aprobó la producción de insulina recombinante por parte de un laboratorio nacional, Denver Farma, cubriendo de esta manera un espacio hasta el momento dominado por empresas extranjeras. La empresa Denver Farma dijo que el mercado de las insulinas es difícil de cuantificar con exactitud en la Argentina, sin embargo según la auditora IMS que mide la venta de insulinas a salida de droguerías, entre mayo del 2005 y abril del 2006 se vendieron 927.237 unidades. La Federación Argentina de Diabetes determinó que de los cerca de 1.5 millones de pacientes diagnosticados, alrededor de 200 mil personas deben administrarse insulina diariamente.

CAPITULO 4: Proteínas recombinantes más vendidas en la Argentina

ERITROPOYETINA (EPO):
La eritropoyetina se utiliza en el tratamiento de la anemia asociada con insuficiencia renal crónica en pacientes adultos y pediátricos en hemodiálisis y en pacientes adultos en diálisis peritoneal.
Al contrario que la insulina, que se obtenía del páncreas de cerdo antes del empleo de insulina recombinante, la EPO no tuvo un origen tan arcaico. Sólo mediante el aislamiento del gen de la EPO, así como mediante clonación y expresión in vitro, fue posible producir la hormona en cantidades suficientes para la terapia con la ayuda de procedimientos de fabricación biotecnológicos.
EPO se produce en Argentina desde 1990 por la compañía Sidus también bajo el nombre de Hemax.
El vehículo de expresión recombinante para la producción de las variantes de Epoetina α y β es en cada caso un subclon genéticamente modificado de una línea celular del ovario de hámster chino (Cricetulus griseus), llamadas células CHO (de Chinese Hamster Ovary). Para la producción de la variante de Epoetina-ω se usa una línea celular genéticamente modificada y subclonada del riñón de hámster dorado sirio (Mesocricetus auratus auratus), conocida como células BHK (de Baby Hamster Kidney).
Todas las variantes de EPO recombinante difieren de las nativas en la composición de las estructuras de azúcares y diferencias entre las propias variantes recombinante.

INSULINA:

La insulina es la hormona secretada por el páncreas, cuya actividad principal es la de regular el metabolismo de los hidratos de carbono y grasas. Se usa para el tratamiento de Diabetes Miellitus.
Las insulinas de tipo recombinante ocupan el 93% de la demanda mundial y se diferencian de las anteriores versiones en que en vez de obtenerse a partir de bovinos o porcinos, se logra mediante fermentación.
Denver Farma, que es el encargado de producir en el país insulina humana, denominada Densulin, constituyéndose en el primer establecimiento de América Latina en fabricar ese medicamento.
Denver Farma es una empresa farmacéutica argentina de capitales y técnicos argentinos, con sólida formación científica y demostrables recursos tecnológicos.


INTERFERON Alfa 2b (IFN 2b):

El interferón alfa es una citoquina de potente actividad inmunomoduladora, antiviral y antiproliferativa. Su complejo mecanismo de acción involucra a la regulación de la transcripción de genes para distintas proteínas celulares y a la estimulación de células efectoras del sistema inmune, resultando en una acción antiviral y antitumoral.
A partir de células de origen humano, se aisla el fragmento de ADN que contiene el gen correspondiente para la síntesis de hu-IFN beta y se clona en un plásmido recombinante capaz de transfectar una línea celular en cultivo.

La construcción genética es integrada al genoma celular permitiendo la expresión de hu-IFNß, que se secreta al medio extracelular.
El interferón beta humano recombinante así sintetizado, es idéntico en su estructura y funcionalidad al nativo.
En Argentina es producido por Bio Sidus S.A. y Laboratorio Delta Farma S.A.

HORMONA DE CRECIMENTO (hGH):

La hormona de crecimiento es una proteína producida por la glándula hipófisis situada en la cara anterior del cerebro. Circula en el torrente sanguíneo y tiene efectos en todo el organismo. En ocasiones es llamada somatotropina o somatotrofina. La hormona de crecimiento utilizada para el tratamiento se denomina somatropina.
Durante muchos años el tratamiento del enanismo hipofisiario fue dificultoso. La única fuente de obtención de hormona de crecimiento era a partir de glándulas hipofisarias extraídas de cadáveres. Estas primeras producciones de hGH no sólo eran escasas, sino que tampoco ofrecían seguridad dado su origen extractivo de glándulas cadavéricas.
A mediados de los años 80', la exitosa producción de hGH a partir de organismos genéticamente modificados, como bacterias o células de mamífero, permitió una amplia disponibilidad de esta proteína que rápidamente se convirtió en el tratamiento de elección para aquella patología. Desde 1997, aplicando la tecnología de ADN recombinante, Bio Sidus produce hGH a partir de la fermentación de bacterias que poseen el gen humano para dicha proteína.

FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS (G-CSF):

El G-CSF recombinante (fligastrim, NEUPOGEN) es una glucoproteína producida en Escherichia coli. Aumenta las funciones fagocíticas y citotóxicas de los neutrófilos. Es eficaz en el tratamiento de neutropenia grave consecutiva a trasplante de médula ósea y quimioterapia a altas dosis.
En Argentina lo producen los laboratorios Pablo Cassará y Bio Sidus SA.

INTERFERON BETA (IFN ):

El interferón beta en la Esclerosis Múltiple tiene efectos inhibitorios en la proliferación de leucocitos y en la presentación de antígenos. Además modula la síntesis de citoquinas hacia la producción de las de tipo antiinflamatorio sobre todo a nivel del SNC.
El Interferón beta 1 a es un interferón glicosilado, producido por tecnología de DNA recombinante por células CHO (ovario de hamster chino) genéticamente modificado. La secuencia aminoacídica es idéntica a la del interferón beta natural. El interferón beta 1 b es un interferón no glicosilado producido por tecnología de DNA recombinante por una cepa de E.Coli. Posee sutiles diferencias estructurales con el interferón.
Biogen Idec Argentina comercializa interferon beta-1a intramuscular. En la actualidad, es el medicamento para la esclerosis múltiple más prescripto en todo el mundo, con más de 135.000 pacientes en tratamiento, y el primero en ser aprobado para pacientes que han sufrido un primer brote de esta enfermedad. En nuestro país, Interferon beta-1a IM fue comercializado anteriormente por Abbott Laboratories S.A.

CAPITULO 5: Laboratorios que producen proteínas recombinantes

A continuación se mencionarán los laboratorios argentinos o internacionales con sede en Argentina que producen proteínas recombinantes.
Baxter
Baxter es una empresa internacional con cede en la Argentina desde 1993. Baxter Argentina SA adquirió Inmuno SA, con lo cual se produjo la integración de ambas compañías. Pertenece al sector productivo salud médica y medicamentos. Produce proteínas recombinantes, tecnología y servicios que contribuyen al tratamiento de la enfermedad renal crónica, hemofilia, enfermedades infecciosas, trastornos del sistema inmune y otras graves enfermedades. En el presente, se desarrolla a través de las siguientes áreas:
• Bioscience
• Transfusión therapies
• Medication delivery. Soluciones
• Parentales_ Sistemas de Infusión_ Nutrición_ anestesia
• Renal
Las proteínas recombinantes que produce se muestran a continuación.

Factor VIII de la coagulación recombinante
Composición: Factor VIII obtenido mediante ingeniería genética a partir de una línea celular de ovario de hamster chino (CHO). El F VIII recombinante posee las mismas propiedades que el F VIII humano.
Indicaciones: Tratamiento de la hemofilia A, complemento en el tratammiento de la hemofilia A agravada por inhibidores y deficiencia de Factor VIII adquirida.
Presentación: Producto liofilizado de 500 y 1000 Ul de Factor VIII, frasco ampolla de 10 ml de solvente y equipo de infusión descartable.
Factor VIII de la coagulación 100 % recombinante, sin derivados de plasma/albumina humano ni animal.
Composición: Factor VIII obtenido mediante ingeniería genética a partir de una línea celular de ovario de hamster chino (CHO). El F VIII recombinante posee las mismas propiedades que el F VIII humano. No hay componentes humanos no animales en la producción del factor.
Indicaciones: Tratamiento de la hemofilia A, complemento en el tratamiento de la hemofilia A agravada por inhibidores y deficiencia de Factor VIII adquirida.
Presentación: Producto liofilizado de 250, 500 y 1000 Ul de Factor VIII, frasco ampolla de 10 ml de solvente y dispositivo Baxject para su preparación.
BioSidus
BioSidus es una empresa que se encuentra dentro del sector productivo salud humana y medicamentos. Se especializa en la generación de materias primas biotecnológicas, en desarrollo biotecnológico en campos vegetal, animal, y salud humana. Producen eritropoyetina recombinante.
Boheringer Ingelheim Argentina.
Dentro de los numerosos medicamentos que produce, desarrolla Actilyce, activador de plasminógeno tisular humano recombinante. A nivel mundial ocupa uno de los principales lugares en el mercado, lo que la ubica como una de las compañías más importantes en el rubro farmacéutico.
GEMA Biotech
Compañía biotecnológica privada con sede central en Buenos Aires Argentina. Focalizada en el desarrollo, producción, purificación, caracterización y ensayos de citoquinas humanas producidas en medio libre de suero para el uso terapéutico.
Algunos de sus productos son: -interleuquina 2 (IL-2) proteína recombinante humana producida en E. coli, indicada para carcinoma renal y melanoma. –Eritropoyetina proteína recombinante producida en células de mamífero, indicada para tratar la anemia. – Interferon alfa 2ª producido en E. coli e indicado para tratar sarcoma de Kaposi, leucemia y hepatitis C crónica.

IDEAR
INDEAR, Instituto de Agrobiotecnología Rosario es la compañía de I+D de Bioceres, la cual tiene en foco a dos áreas temáticas: el mejoramiento de cultivos para aumentar su productividad y la producción de enzimas industriales en plantas. Para esto, INDEAR utiliza las herramientas de la biología molecular moderna vía estrategias de organismos modificados genéticamente y no modificados genéticamente. El proyecto se basa en la producción de la quimosina en plantas de cártamo, la cual es una enzima de amplia utilización en la industria láctea, para la coagulación de la leche en la producción de quesos. El proyecto está completo respecto de las etapas de I+D y actualmente busca socios interesados en la producción y comercialización del producto.


Laboratorio Pablo Cassará SRL
El Laboratorio Pablo Cassará se especializa en el sector productivo salud humana y medicamentos. Produce proteínas recombinantes en sistemas procariontes. Uno de sus principales productos es el GCSF.
Laboratorio Purissimus
Las proteínas recombinantes que produce Laboratorio Purissimus son inmunoglobulinas, albúmina, factor VIII, IgG anti D, IgG ant hepatitis B, factor IX y complejo protombínico. Se trata de una empresa argentina que consiste en una planta de hemoderivados en donde se purifican derivados del plasma. La empresa se dedica, además a la seguridad viral de hemoderivados.

PBL
PBL, Productos Bio-Lógicos, pertenece al sector productivo de reactivos y diagnóstico. Es un emprendimiento que surgió en el 2001 dentro del programa de incubación de empresas de la UNQ. Se especializa en desarrollo, producción de reactivos e insumos para las tareas de investigación, diagnóstico e industria mediante ingeniería genética y la biotecnología. Producen Taq Pegasus, una ADN polimerasa termoestable recombinante.

PC Gen
El laboratorio PC gen una empresa incubada y pertenece al sector productivo salud humana y medicamentos. PC-Gen ha desarrollado productos como Interferón alfa, Interleukina 2 y GM-CSF y eritropoyetina.
En el caso de eritropoyetina, ha desarrollado clones y establecido los criterios de purificación de la proteína. Por otra parte, se han establecido todos los criterios analíticos de acuerdo a Farmacopea Europea. PC-Gen cuenta con un departamento de control de calidad en el análisis y caracterización de productos biotecnológicos.
Zelltek
El laboratorio Zelltek pertenece al sector productivo salud humana y medicamentos. Es una empresa de desarrollo, producción y comercialización de productos de interés terapéutico destinado al mercado farmacéutico. Produce eritropoyetina humana recombinante. Focalizados en la producción de nuevos productos para el tratamiento del cáncer e infecciones virales.

CAPITULO 6: Desarrollos en curso

En estos momentos, el laboratorio BioSidus S.A. maneja distintos productos que se producen en la planta y se comercializan en el país y en distintas partes del mundo. Las dos grandes líneas que se trabajan en la actualidad son, por un lado, los productos de fermentación en bacterias y por el otro, los expresados en células.
En cuanto a inversión y desarrollo, para sus proyectos, Bio Sidus cuenta con un presupuesto anual de inversión que ronda los u$s 8 millones y hay tres principales megaproyectos de investigación.
- El primero se refiere al desarrollo de terapias génicas en el que están trabajando fuertemente en la aplicación del gen del factor de revascularización para problemas coronarios y obstrucciones periféricas. Este proyecto lleva un par de años de trabajo con la Fundación Favaloro y con el Instituto de la Inmaculata de Roma. Por ahora, permanecen en la etapa de estudio con animales. Una gran posibilidad sería, en lugar de usar los genes para insertarlos en algún elemento biológico y producir proteínas que se puedan llevar al organismo, que el gen actúe en él directamente.
- El segundo gran proyecto se basa en animales transgénicos, con lo cual están trabajando hace 4 años tratando de buscar el animal como reactor biológico para la producción de proteínas recombinantes que necesitan mayor masa y, por consiguiente, mayor volumen de reactor. Una solución podría ser producir un gen y expresar esa proteína, por ejemplo, en la leche de la vaca o de la cabra, donde, luego, se hace un proceso de purificación hasta aislar la proteína. Actualmente están en la fase de desarrollo de trabajo con animales y es un proceso que debe madurar en los próximos 5 años.

Los animales transgénicos son aquellos que poseen un gen que no les pertenece a su especie. Generalmente, y la forma más sencilla para generar un animal transgénico requiere primero aislar el gen que se desea introducir en el genoma del animal. Este gen que no pertenece al genoma de la especie del animal se denomina transgen. Esto requiere el empleo de tecnología de ADN recombinante e ingeniería genética, técnicas básicas de biología molecular y su uso es muy extendido en biotecnología.
Esta tecnología requiere clonación y manipulación del genoma para que pueda ser insertado en el genoma y expresado por el nuevo organismo. A fin de que las células del organismo expresen este nuevo gen o transgen, se debe incorporar dicho transgen en un embrión en sus estadios iniciales, cuando es un cigoto. Luego de asegurarse que el transgen fue efectivamente clonado en el embrión, se debe proceder a implantar el embrión en un animal receptivo. Todo este procedimiento requiere una cuidadosa tecnología de fertilización “in vitro” .

En el caso que no interese que todas las células del animal contengan el transgen, sino algunas células específicas o tejido específicos se debe efectuar un procedimiento similar al ya descripto, pero en lugar de inyectar el transgen en el cigoto, se inyecta en el embrión en etapas más tardías. Por medio de aplicar este tipo de tecnología de transgénesis se obtiene un animal donde algunas células contienen el genoma normal de la especie, y otras células tienen incorporado en su genoma el transgen.
En Argentina se ha efectuado con éxito la tecnología de transgénesis en animales, llevando a la creación de las vacas transgénicas. Estas vacas transgénicas se han diseñado para que produzcan en su leche la hormona de crecimiento humano y otras productoras de insulina, de la misma forma. Este desarrollo biotecnológico fue un emprendimiento efectuado entre la Universidad de Buenos Aires y la empresa Bio Sidus. Sin lugar a dudas es un desarrollo en biotecnología de avanzada en la región y porque no también a nivel internacional.
La aplicación de la tecnología de animales transgénicos presenta nuevas oportunidades de desarrollo biotecnológico y puede brindar a la sociedad la oportunidad de su aplicación tanto en biomedicina, como en otras áreas de la biotecnología, abarcando un amplio espectro en las áreas de desarrollo y producción. Sin lugar a dudas la transgénesis ha causado una revolución en biotecnología, planteando además nuevos desafíos éticos y morales.



Esquema 3: pasos generales en el desarrollo de animales transgénicos de Bio Sidus S.A.

- Por último, la otra línea importante es un proyecto con plantas transgénicas a 5/6 años, Bio Sidus tiene una División de Biotecnología Vegetal, donde está trabajando en el desarrollo de herramientas para la aplicación de la biotecnología vegetal con el propósito de que, en un futuro, se pueda trabajar en un modelo de planta transgénica que pueda servir para producir proteína recombinante.

Productos (desarrollo en curso) por Bio Sidus:

- Parathormona humana por síntesis química: Hormona que induce la formación de tejido óseo; entre otros usos sobresale su potencial eficacia en el tratamiento de la osteoporosis.
- Estreptoquinasa recombinante: Trombolítico.
- Producción de hGH en animales transgénicos: Se procura direccionar la síntesis de hGH humana a la glándula mamaria buscando su secreción en leche de vacas transgénicas.
- Terapia Génica de Revascularización: Mediante el uso de vectores no virales se trata de restablecer la red de arterias en tejidos con problemas circulatorios (isquemias cardíacas y problemas de circulación periférica en piernas y brazos)
- Biotecnología Vegetal: trabaja en la producción de distintas proteínas en plantas transgénicas, así como en la mejora de varias especies vegetales, otorgándoles resistencia a virus y/o herbicidas.
- Terapia anti-IFN
- Vacuna anti TAT

Productos (desarrollo en curso) por Universidad del Litoral

Fármaco contra el cáncer “GM-CSF”, sigla en inglés correspondiente a “Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos y Macrófagos”: contribuye a la quimio y radioterapia contra el cáncer al proteger a las células defensivas del organismo, que así puede tolerar dosis mayores contra el tumor. El “GM-CSF” que hay en el mercado proviene de bacterias o levaduras; el de la Universidad del Litoral se produce a partir de células de mamíferos, lo cual evita efectos adversos. El proyecto está prácticamente terminado y estan por poner en marcha ensayos clínicos de este producto. Hay otros dos productos en desarrollo pero, como son patentables, no pueden darlos a conocer por razones de confidencialidad.

CAPITULO 7: Buenas prácticas de manufactura y
procedimientos operativos estandarizados

Las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) ó Good Manufacturing Practices (GMP) son prácticas de higiene recomendadas para que el manejo de materiales garantice la obtención de productos inocuos.
Procedimientos Operativos Estandarizados (POES ó SSOP Sanitation Standard Operating Procedures): son aquellos procedimientos escritos que describen y explican como realizar una tarea para lograr un fin específico, de la mejor manera posible. Existen varia actividades/operaciones, además de las de limpieza y desinfección, que se llevan a cabo en un establecimiento elaborador que resulta conveniente estandarizar y dejar constancia escrita de ello para evitar errores que pudieran atentar contra la inocuidad del producto final.
Según la Food And Drug Administration (FDA) POES abarcan:
* Manutención general
* Sustancias usadas para limpieza y saneamiento
* Almacenamiento de materiales tóxicos
* Control de plagas
* Higiene de las superficies de contacto con alimentos
* Almacenamiento y manipulación de equipos y utensilios limpios
* Retirada de la basura y residuos

Si el establecimiento o la autoridad sanitaria detectaran que el POES falló en la prevención de la contaminación ó adulteración del producto, se deben implementar medidas correctivas. Estas incluirán la correcta disposición del producto afectado, la reinstauración de las condiciones sanitarias adecuadas y la toma de medidas para prevenir su recurrencia.
El establecimiento debe llevar además, registros diarios suficientes para documentar la implementación y el monitoreo de los POES y de toda acción correctiva tomada. Estos registros deben estar disponibles cuando la Autoridad Sanitaria así lo solicite.
Cada establecimiento de contar con su propio “ Manual de POES” donde se describen todos los procedimientos de limpieza y desinfección que se realizan periódicamente antes y durante las operaciones que sean suficientes para prevenir la contaminación ó adulteración de los productos que allí se manipulan.
Una vez desarrollado cada POES será firmado y fechado por un empleado responsable/supervisor con autoridad superior. Esta firma significa que el establecimiento implementará los POES tal cual han sido escritos y, en caso de ser necesario, revisará los POES de acuerdo a los requerimientos normativos para mantener la inocuidad los productos que allí se manipulan.
Los POES son realizados para todas las operaciones y todos los turnos de actividad.
Estos procedimientos deben ser monitoreados, verificada su eficacia y en caso de considerarse necesario, revisados con cierta frecuencia.
Resulta esencial el entrenamiento de los empleados para la aplicación de POES y el énfasis en la importancia de seguir las instrucciones de cada procedimiento para lograr la inocuidad de los productos.

CAPITULO 8: Entidades regulatorias. Exigencias

Los procesos de producción atienden ciertas normas que difieren según el producto que se elabore: medicamentos por un lado, alimentos por otro, etc. El producto, además, requiere de una evaluación exhaustiva que determine que es inocuo para la gente, los animales y/o el ambiente, y que tenga el efecto esperado. Dependiendo del producto, y del proceso para obtenerlo, las normas reguladoras cambian.

En Argentina, la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología médica (ANMAT) se encarga de registrar, controlar, fiscalizar y vigilar la sanidad y calidad de:
• Medicamentos
• Alimentos
• Productos médicos
• Cosméticos, de Higiene y Tocador
• Domisanitarios
• Reactivos de Diagnóstico
• Suplementos Dietarios
• Y todos aquellos que se consumen o utilizan en la medicina, alimentación y cosmética humana
Para la reglamentación de los distintos productos, existen dentro del ANMAT institutos particulares. Por ejemplo.
• el INAME (Instituto Nacional de Medicamentos) controla y fiscaliza la sanidad y la calidad de las drogas, productos químicos, reactivos, medicamentos, elementos de diagnóstico, productos de higiene, tocador, y cosmética humana, ya se trate de productos de origen nacional o importados. También, ejerce las actividades de fiscalización de los establecimientos que realizan actividades de elaboración, importación y en algunos casos de distribución de dichos productos.
El campo de acción de este Instituto debe abarcar además, el estudio, generación y proposición de legislaciones y normativas que contemplen nuevos desarrollos de productos o procesos de forma tal que el proceso de evaluación y aprobación de los mismos no constituya una traba burocrática que retarde el acceso de la población a nuevos productos de competencia del INAME.
• el INAL (Instituto Nacional de Alimentos), controla y fiscaliza la sanidad y la calidad de los alimentos, incluyendo aditivos, colorantes, edulcorantes e ingredientes utilizados en la alimentación humana, como también de los suplementos dietarios, productos de uso doméstico y de los materiales en contacto con los alimentos.
• la DEM (Dirección de Evaluación de Medicamentos) tiene a su cargo la evaluación clínica de los medicamentos.
• CONVISA, Comisión Nacional de Biotecnología y Salud,es la autoridad reguladora de la biotecnología aplicada a la salud. La misma fue creada por la Resolución Nº 413/93, del director de la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología (ANMAT). Tiene como misión asesorar al gobierno nacional en lo referido al desarrollo y la aplicación de la biotecnología en el campo de la salud. Estudia y recomienda las normas vigentes que rigen el desarrollo, elaboración y aprobación de productos biotecnológicos destinados a la salud y el consumo humano.
En lo referente a la regulación de proteínas recombinantes, en la Argentina no hay disposiciones específicamente desarrolladas para la regulación de dichos productos biológicos/biotecnológicos. Es decir, no existe una clasificación que se encuentre integrada por estos productos, más bien serán clasificados y regulados de acuerdo a otras propiedades de los mismos. Por ejemplo, la insulina, la cual pertenece a un grupo especial de medicamentos denominados de ventana estrecha, es decir, que por debajo de ciertas dosis no tienen eficacia y por encima de ciertas dosis son tóxicas. Cualquier nuevo producto que se apruebe debería demostrar algún tipo de equivalencia con las cuatro que se comercializan en la actualidad. Pero el año pasado, por ejemplo, fue aprobada una insulina que si bien no se comercializa, no presentó ningún tipo de estudio de biosimilaridad. De esta manera, es posible encontrar productos no avalados por ningún ensayo o estudio serio.


Protocolos de investigación clínica
Para que un producto farmacéutico llegue al mercado y al público, antes debe pasar por una serie de exhaustivos análisis, en su conjunto conocidos como Ensayos preclínicos y Ensayos clínicos. En una primera etapa de desarrollo, la nueva droga debe ser evaluada en animales modelo, para investigar cómo se distribuye en el organismo, y cuáles son sus efectos positivos y negativos. Si esta etapa se supera con éxito, comienzan los ensayos clínicos con personas voluntarias, que deben cumplir una serie estricta de requisitos para poder participar de los mismos. Dentro de los ensayos clínicos, se distinguen distintas fases (I, II, III) en las cuáles se evalúa la dosis óptima, la efectividad para el tratamiento de la enfermedad en estudio, y los efectos adversos o no deseados. En función de los resultados, la droga es aprobada o no para su uso como medicamento en seres humanos.
En algunos casos el marco regulador es el mismo independientemente de la forma de obtención. Pero, en otros casos es diferente, como en la obtención de insulina en leche de vacas transgénicas, o el caso del maíz Bt.
Ejemplo en la realización de un protocolo de ensayos clínicos en la Argentina para el componente A, el cual es una proteína recombinante .
Visita de iniciación 7 de noviembre del 2007. Estudio abierto en Fase IIIb para el tratamiento en primera línea del componente A más taxanos en monoterapia o combinación, de pacientes con cáncer de mama metastático o con recidivia local.
El protocolo del componente A tiene como objetivo primario evaluar el perfil de seguridad del componente A cuando se combina con otros medicamentos en pacientes con CMm o RL. Como objetivo secundario, se intenta evaluar la eficacia, en las mismas condiciones para determinar el perfil de seguridad. La eficacia del componente A se mide como el tiempo hasta la progresión de la enfermedad (TP) y sobrevida total (ST). Por otra parte, se pretende evaluar la seguridad del componente A en pacientes que desarrollan metástasis en SNC, durante el tratamiento y en los seis meses siguientes al mismo. Los objetivos mencionados para este protocolo en particular, evaluación de la seguridad y eficacia, se comparten con otros protocolos ya que, son indispensables para determinar la aprobación del medicamento que esta siendo evaluado.
Generalidades
El número de pacientes a fines de octubre fue de 1146 incluidos a nivel mundial y el número de centros que participaron del protocolo fueron 400 para el protocolo del componente A. Las cifras mencionadas para este protocolo en particular, dan a entender la importancia de ampliar el número poblacional para evaluar la acción terapéutica de los medicamentos en vías de aprobación. Dado que el número de pacientes sobre el cual se evalúa es de gran magnitud y recoge datos a nivel mundial, permite hacer los análisis estadísticos correspondientes y más representativos.
Duración del estudio
La duración del protocolo mencionado tiene implicancias generales a los demás protocolos de investigación clínica. En este caso particular, los pacientes recibirán el componente A hasta la progresión de la enfermedad, el desarrollo de la toxicidad inaceptable, retiro del consentimiento del paciente o hasta el fin del estudio. Es en este punto donde interviene las normativas sobre los estudios clínicos. El investigador a cargo deberá ser responsable en permitir la salida de un paciente del protocolo, si está su salud y vida en peligro. Aquí juega un rol importante las normas de ética médica, a saber:

• Declaración de Helsinki de la asociación Médica Mundial,
• Principios Éticos para las Investigaciones Médicas en seres humanos y sus sucesivas modificaciones,
• Guidelines For Good Clinical Practice E6 ,
• Pautas Éticas Internacionales para la Investigación Biomédica en seres humanos, preparadas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas (CIOMS) en colaboración con la OMS,
• Principios éticos básicos enunciados en el reporte de Belmont,
• Finalmente, las leyes y reglamentos emanados por las autoridades de la salud de la República Argentina.
El cumplimiento de las normas y reglamentos vigentes son evaluados por el Comité de Ética Independiente, tanto interno como externo pertenecientes al protocolo puesto en marcha y la entidad nacional reguladora correspondiente: ANMAT. Las pautas involucradas en el protocolo no solo afectan la dedición del investigador principal, sino de todos los participantes del mismo.
Criterios de elegibilidad
Los pacientes que integren el protocolo deberán adecuarse a los criterios de elegibilidad para ser seleccionados. Estos son dos, los criterios de inclusión y los criterios de exclusión. El paciente podrá cumplir algún requisito explicitado en el criterio de inclusión pero, no deberá reunir ningún criterio de exclusión. Por ejemplo, para el protocolo del componente A los criterios de inclusión comprenden el consentimiento informado por escrito obtenido antes de cualquier procedimiento específico del estudio, función hematológica, hepática y renal adecuada y prueba sérica de embarazo. Por otra parte, puede mencionarse ejemplos del criterio de exclusión como, quimioterapia previa a CMm o RL y cirugía mayor.
Esquemas del protocolo
El protocolo esta constituido por una serie de estapas, las cuales son enrolamiento o screening, visita baseline, visitas por ciclo, visita final, visitas de seguimiento, finalmente, visita de sobrevida. El esquema a llevar a cabo durante la realización del protocolo se muestra a continuación.



Esquema 4: realización de un protocolo

Sreening y evaluaciones iniciales
Durante esta fase del tratamiento se debe obtener la firma del consentimiento informado de todos los pacientes antes de cualquier procedimiento específico del estudio. El investigador deberá confirmar la elegibilidad del paciente según los criterios de inclusión y exclusión del estudio. Las evaluaciones de screening y la visita de evaluación basal deberán realizarse dentro de los 28 días de la primera infusión del medicamento en evaluación. Los pacientes que no reúnan los criterios de elegibilidad no serán enrolados. Una vez que se haya confirmado la elegibilidad del paciente, se le asignará un número de enrolamiento, para el protocolo ejemplificado, mediante el sitio web del eCRF
Fases del tratamiento
En cada ciclo, se registran datos en el eCRF, los cuales consisten en análisis clínicos del paciente enrolado. Puede mencionarse a modo de ejemplo, algunos datos requeridos como peso, PA y análisis de orina. Se informa regularmente la evaluación de la respuesta al tratamiento según el estándar de atención. Se deberá monitoriar los siguientes ítems en forma continúa y, en cada ciclo, se registran los datos en el eCRF.
• EAs, eventos adversos.
• EAs de interés especial
• Medicación y terapia concomitante

Final del tratamiento
El final del tratamiento, con el componente A, el cual puede aplicarse cualquier otro medicamento en fase de evaluación, finalizará cuando se presente alguno de los siguientes:
• Se diagnostique progresión de la enfermedad
• Se presente toxicidad inaceptable en opinión del investigador o del paciente
• El paciente abandone el estudio prematuramente
• Se llegue al final del estudio.
• Si el paciente suspendiera el medicamento en fase de evaluación debido a toxicidad inaceptable o por cualquier otro motivo antes de la progresión de la enfermedad, pero continuara con quimioterapia, ingresará a la fase de seguimiento.
Confidencialidad de los registros
Cada uno de los datos que se obtienen sobre los pacientes durante la realización del protocolo son confidenciales. Por ejemplo, la información recabada en el formulario de información y autorización para la recolección de datos de la pareja embarazada es confidencial dentro de los límites permitidos por la ley vigente en la República Argentina de Protección de Datos personales Nº 25326. Si bien los datos no serán revelados, las autoridades sanitarias, ANMAT y el Comité Independiente de Ética para ensayos en Farmacología Clínica, pueden examinar estos datos para asegurar que el estudio sea realizado apropiadamente.
Regulación para OGM
Cuando de organismos transgénicos (OGM) se trata, en Argentina se requiere de su evaluación satisfactoria por distintas entidades públicas:
• la CONABIA (Comisión Nacional de Biotecnología Agropecuaria) evalúa la inocuidad del OGM para el medio ambiente;
• el SENASA (Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria) evalúa su inocuidad alimentaria,
• la DNMA (Dirección Nacional de Mercados Agroalimentarios), evalúa el impacto que la comercialización del OGM en estudio tendrá sobre los mercados internos y externos.
Además, si el producto será usado como medicamento, también debe evaluarse mediante ensayos clínicos en el marco de la ANMAT, como se mencionó previamente.
De esta forma se garantiza que el producto llegue a la población de una manera correcta y aprovechable.

Regulación de biosimilares en la Argentina
En este momento muchas patentes sobre proteínas recombinantes y otros productos biotecnológicos han expirado o están próximos a hacerlo. En estas condiciones legales surgen productos no innovadores o biosimilares, es decir, se pretenden generar productos similares a los innovadores de referencia. Los biosimilares intentan tener el mismo mecanismo de acción y buscan ser utilizados para la misma indicación terapéutica del biofármaco original. Es crítico considerar que, la producción de proteínas recombinantes no es idéntica en un sistema de expresión diferente, aún si el mismo está enteramente emparentado. Las normas y regulaciones sujetas a aprobación los productos no innovadores deberían construirse sobre la base de una consciencia sobre las potenciales diferencias entre ambos productos biotecnológicos.
Existen numerosas razones por las cuales un biosimilar no puede ser aprobado sin determinar su similaridad, rigurosidad y calidad. Un biosimilar no puede ser considerado biogenérico, en analogía con los productos de síntesis química. Estas razones se enuncian a continuación.
• Existe una gran dificultad o una imposibilidad en la generación de una proteína como réplica de otra en condiciones similares pero no idénticas. De hecho dentro de un mismo lote, es posible que se encuentren muestras que difieran de otras. No es posible, en condiciones de semejanza garantizar la identidad en la estructura química, la estabilidad, farmacocinética, la farmacodinámica, la biodisponibilidad y bioequivalencia, debido al gran tamaño molecular de las proteínas y al proceso de manufactura.
• Los métodos tradicionales de análisis químico no son suficientes para determinar la similitud en la identidad de las proteínas. Las alteraciones que pueden sufrir son diversas, por ejemplo, alteraciones en los enlaces no covalentes, en los enlaces no covalentes: hidrólisis, deaminación, formación de iminas, racemización (formas tridimensionales diferentes) mediante una oxidación, intercambio de bisulfitos, isomerización (diferentes posiciones en le espacio) y fotodescomposición.
• Secuencia de aminoácidos, glicosilación, pureza, excipientes, estabilidad, dosis y vias de administración, intervalos de dosis, sistema inmune del huésped y el almacenaje.
• La potencial inmunogenicidad no evaluada en los productos no innovadores
Las modificaciones en el producto no innovador que lo diferencian del producto innovador de referencia pueden conducir a consecuencias graves en la acción terapéutica del mismo, la principal desventaja que presentan los biosimilares es su potencial efecto inmunogénico, el cual debería ser evaluado mediante ensayos en humanos. El efecto inmunogénico implica la formación de anticuerpos dirigidos contra el mismo producto biológico o proteínas propias del paciente.
La ruta de administración, también puede provocar inmunogenicidad. La vía intravenosa produce menos inmunogenicidad que la ruta intramuscular o subcutánea. También la calidad del producto puede dispara la generación de anticuerpos. Se reportó inmunogenicidad en un producto por presentar grumos, mientras que el producto soluble, no. La inmunogenicidad, también está asociada al estado de salud del paciente.
La principal implicancia en la inmunogenicidad es la incapacidad de determinarla sin investigación clínica, por lo cual no puede rápidamente aprobarse el biosimilar, de esta manera se requiere disponer del recurso económico para llevar a cabo dichos estudios en humanos.
Posición de la Argentina frente a la regulación de los productos biosimilares.
El 25 de junio de 1999, la ANMAT promulgó la Disposición 3185/99, tomando parcialmente en consideración las recomendaciones de WHO-96 y contemplando comenzar con un listado de drogas críticas seleccionadas por prioridades.
El producto de referencia natural es el innovador y, en su efecto, el establecido por la autoridad sanitaria. La ANMAT disiente en algunos de los criterios armonizados (WHO-96), como por ejemplo, el hecho de que se exonera de estudios de bioequivalencia in vivo, a todos los productos orales bajo la forma de comprimidos y cápsulas de liberación simple, consideradas "sin riesgo sanitario significativo". Asimismo, a todos los productos de aplicación tópica (ótica, oftálmica, nasal, dermatológica, inhalaciones / aerosoles nasales) cuando tengan esencialmente los mismos excipientes que el producto de referencia, pero definiendo que dos excipientes son esencialmente los mismos, si cumplen la misma función en la formulación del producto (dispersante, agregante, espesante), 'aunque no tengan la misma molécula'.
Regulación de los biosimilares por los organismos Internacionales
En la actualidad, no todos los países de Latinoamérica tienen legislaciones robustas sobre la regulación de los biosimilares o quizá como Argentina solo comparten parcialmente con criterios establecidos. Por ello, es de suma importancia, tomar como referente a aquellos países que se han adelantado en la redacción de normas y se encuentran en mayor medida consolidados en esta dinámica. La FDA; la EMEA, European Mediacal Agency; la OPS/OMS, Organización Panamericana de la Salud en conjunción con la Organización Mundial de Salud y FIFARMA, Federación Latinoamericana de la Industria Farmacéutica, son aquellas organizaciones que han desarrollado su propio sistema de legislación.
FIFARMA ha dado a conocer su posición acerca del modo de aprobación de los productos no innovadores, los biosimilares. Su posición es conciente y responsable, ya que considera con gran claridad las condiciones de regularización en América Latina. Su posición fue especificada en el Documento Oficial de posición de la Federación Latinoamericana de la Industria Farmacéutica (FIFARMA), en marzo del 2006. Se menciona en dicho documento, que no promueven la aprobación de los biosimilares del mismo modo a como se realiza con los genéricos para medicamentos de síntesis química. Se requieren estudios clínicos para establecer la eficacia y seguridad de los productos farmacéuticos biológicos, incluso si afirman igualdad en composición, manufactura y control. Expone, además, que la ausencia de un sistema de farmacovigilancia en la mayoría de los países de Latinoamérica es una razón más para evitar incorporar al mercado los mencionados productos, ya que, los mismos no serán estudiados en el tiempo posterior a su comercialización. No obstante, esta situación no es la que se presenta en nuestro país. La farmacovigilancia es llevada a cabo por el ANMAT y los laboratorios de alto prestigio incluyen sistemas de farmacovigilancia propios, como es el caso de Roche.
Criterios propuestos por la OPS
La OPS ha propuesto una serie de criterios científicos para la determinación de la bioquivalencia, de acuerdo a "Multisource (generic) pharmaceutical products: Guidelines on registration requirements to establish interchangeability", WHO Technical Report Series, Nº 863, 1996 (WHO-96). Asimismo, la OPS realizó una Reunión de Consulta de Expertos en Bioequivalencia de Productos Farmacéuticos en Caracas, 13-15 de enero de 1999 (REBQ-Caracas 99) con el objetivo de orientar la implementación de normativas de bioequivalencia armonizadas en nuestros países y patrocinó la 2ª Conferencia Panamericana sobre Armonización de la Reglamentación Farmacéutica, que tomó las conclusiones y recomendaciones de la REBQ-Caracas 99.

A nivel mundial han sido estandarizadas metodologías clínicas, bioanalíticas y estadísticas usuales de estos estudios. Para el análisis del nivel seguridad en un estudio de bioequivalencia, los voluntarios saludables son expuestos en dosis únicas seguidas de un período de lavado entre ellas (caso general) o regímenes múltiples con el mínimo de dosificaciones que sea posible, a una droga que no hubiese sido aprobada por las Autoridades Regulatorias para ser usada en humanos. Además, se explicita la necesidad de estudios bioanalíticos, que requiere la recolección de muestras de sangre u orina; la infraestructura humana necesaria, es decir, los investigadores y el resto del personal que compone un esquema de trabajo para el protocolo. Estos estudios deben ser efectuados de acuerdo con las Buenas Prácticas Clínicas. Además, se menciona el requerimiento de infraestructura material para el componente bioanalítico, el cual debe cumplir las GMP para asegurar la valides de los estudios realizados. Por otra parte, se menciona la necesidad de infraestructura material para el componente estadístico, el cual consiste en los materiales requeridos para la evaluación estadística de los datos recolectados. Finalmente, se menciona acerca de los procedimientos de inspección y de auditoría, los cuales controlan el cumplimiento de los protocolos, la selección de los sujetos, la verificación del cumplimiento del diseño cruzado (u otro) previsto en el protocolo y de la administración de los productos de acuerdo a los lotes seleccionados para el estudio, la recolección, manipulación y almacenamiento de las muestras biológicas y la validación de los métodos analíticos y los procedimientos.